第二代试管婴儿的适应症、风险评估及对策

引言

ICSI最主要的适应症是由于少精或精子功能异常引起的男性不育，同时也适用于许多其他指征，临床试验表明ICSI在临床妊娠率方面不比IVF更有效。对于无精症患者，ICSI所需的精子可以从附睾或睾丸获得，甚至非嵌合体的克氏综合征男性也可以通过ICSI获得妊娠；但是值得注意的是，迄今为止这种患者后代的核型几乎都异常。有的严重男性不育和其他的精子异常与遗传异常有关，在这些ICSI周期中非整倍体胚胎有可能增加，所以行ICSI的夫妇需要进行遗传咨询， PGD在这些周期中可能有一定的应用价值。同样，在PGD周期中人们可能更偏爱ICSI，因为ICSI较高的受精率可以提供更多供检测的有效胚胎和更多供移植的正常胚胎，尤其ICSI可以避免外源性DNA的污染。

自从ICSI技术应用以来，人们已系统地研究了关于ICSI新生儿和家庭的结果。尽管ICSI的受精率可能比IVF高，能获得更多的胚胎，但目前胚胎移植目标是限制高多胎妊娠率的发生。由于实行ICSI助孕的夫妇中女性卵巢功能往往是正常的，并且ICSI的受精率高，事实表明我们有可能重新考虑和使用伤害更小的促排卵与胚胎移植方案。

适应症和效果

ICSI曾被推荐用于治疗严重男性不育（表1）、临界性男性不育以及不明原因的不育。据报道，新鲜非供卵或供胚的辅助生殖周期一半以上采用ICSI（表2），其中，只有半数的ICSI周期是男性因素，并且其成功率比非男性因素不育症低。尽管有关于ICSI低活产率的报道，但很多人还是提倡ICSI适用于所有的辅助生殖病例。

表1：目前ICSI的适应症

自主射精

少精子症

畸形精子症

精子活力不足（限于100％不活动精子）

畸形活精子症（按严格标准形态学正常的精子≤4％－限于球形精子）

抗精子抗体滴度高于正常

传统的IVF-ET后反复受精失败

癌症缓解期病人保存的冻精

射精紊乱（如电射精、逆行射精）

附睾精子

先天性双层输精管缺如

Young综合征

输精管附睾吻合术失败

输精管－输精管吻合术失败

双侧射精管阻塞

睾丸精子

附睾精子的所有指征

纤维化所致附睾取精失败

睾丸衰竭导致的无精子症（成熟障碍、生精细胞发育不全）

死精子症

严重男性不育

自从1992年报道的4例ICSI妊娠后，没有人再以妊娠或分娩作为结果做随机对照研究以评估ICSI治疗严重男性不育症的效果。然而在这种临床情况下也不需要上述研究，因为ICSI的活产率已经远远比宫腔内人工授精（IUI）、促排卵IUI、传统的IVF、局部透明代切割或透明带下精子注射高。更重要的是，现在可以从男性生殖道取精，即使仅仅只有少量的单个精子也可行ICSI。不过在非梗阻性无精症患者中，手术取精比自然射精的受精率低。总之，如果精子发育成熟到一定程度（如伸长的精子细胞），就有可能受精；圆形精子的受精及胚胎形成还缺乏有力的证据。

非男性因素不育和非严重男性不育

ICSI也被用于治疗临界性和中度男性不育症。大多数比较IVF和ICSI的实验，是将同源的卵子随即分组，比较受精率。因此，这些实验不能够提供有关妊娠率方面的信息。在两篇综述中，ICSI的受精率比IVF高。在一个具有同源卵子的实验中，使用较高浓度精子的IVF的受精率与ICSI相似：分别为IVF 60％（平均每个卵子周围20000个精子）ICSI 68％（差别不显著），和IVF 37％（平均每个卵子周围5000个精子）ICSI 64％（P＜0.007)。目前为止，还没有一项实验评价授精浓度与活产率的关系。

尽管在同源卵子实验中ICSI的受精率比IVF高，但ICSI的妊娠率并不高，提示ICSI应该用于严重的男性因素不育症；也有作者认为同时也要研究卵巢反应性或卵子质量差的患者。

受精失败

很少发生卵子都不受精的情况，在IVF周期中，总的受精失败的发生率不超过1－2％。

ICSI被认为是受精失败的一级或二级预防措施。ICSI作为一级预防措施，可以用一项英国的研究来评估，该项研究排除了在前一次IVF周期中受精率＜20％的夫妇。受精失败发生情况：206例IVF患者11例（5％）不受精，209例ICSI患者4例（2％）不受精。这3％的差别意味着ICSI将可以预防没有受精失败高风险周期的受精失败。

对于有受精失败或低受精史的夫妇，没有最新的随机研究认为ICSI可以作为二级预防受精失败的措施。2005年的一项研究包括24例先前受精失败的患者和14例先前受精率＜25%的患者。在先行IVF的24例和14例患者中，应用ICSI后的受精率分别是16例（67％）和7例（50％），均高于IVF。

其他适应症

PGD过程中，精子所引起的污染可能影响PCR结果，ICSI的使用能使污染的可能性降到最小。

手术取精

合理治疗无精子症的前提是区分梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症，非梗阻性无精症常包括精子发生障碍。病史、体格检查和内分泌评估都很必要，但是只有睾丸组织学检查可以提供明确诊断。

梗阻性无精子症

在ICSI应用以前，通过手术取出附睾中的精子用于IVF。ICSI技术的诞生促进了这项成就的发展，因为精子活力不再是一个限制因素。附睾取精可以通过显微手术或盲法抽吸。

获得和使用睾丸精子是一个合乎逻辑的发展，因为前进性运动，不是ICSI所必需的。睾丸精子最初从开放性睾丸活检中提取获得精子（TESE），结果示新鲜与冷冻的精子样本是相似的。

在实践中，男性阻塞性无精子症使用显微外科附睾抽吸精子，可取到足够精子并立即进行授精和超低温保存。经皮附睾精子抽吸，获得精子量只够进行一次ICSI程序，但是创伤小，因此，它通常是第一选择。非梗阻性无精子症男子，通常附睾没有精子而需要睾丸活检，细针穿刺（FNA） （TESA ）或开放性TESE都可以。开放性活检程序包括随机活检和显微解剖。虽然两种开放性睾丸活检程序会引起暂时性睾酮下降和FSH升高，但是在显微解剖组急、慢性超声变化更少，显微解剖组精子获得率为57 ％，而随机活检为3 2 ％。

FNA被提出后，就不再有必要进行阴囊探查，多数病例使用获得的附睾精子或TESE 。这是基本的，在证实阻塞确实存在的情况下：睾丸活检并冻存是一种有效的方法，一旦诊断确定后，可以做FNA或可以从冰冻组织中获得精子。如果梗阻性无精子症是由于后天的附睾感染或输精管结扎术导致阻塞，没有必要再特地检测。但是，如果是先天性无附睾，夫妇俩必须测试囊性纤维化DF 508突变。

非梗阻性无精子症

非梗阻性无精子症常是先天性的，但也可能是化疗或放疗所致。直到1995年才有关于非梗阻性无精子症患者睾丸活检取精ICSI后获妊娠的报道。睾丸活检对于明确诊断是生精细胞发育不全（支持细胞仅存综合症）还是成熟障碍是必要的。

生精细胞发育不全时FSH升高，而精子存在成熟障碍时FSH正常。由于睾丸组织的不均一性，虽然睾丸活检可以提供诊断，但是不能预测能否在睾丸里找到生精细胞。如果能够发现精子，可以立即使用或者冻存供以后使用，每次移植的妊娠率约是15％；还没有圆形精子细胞受精后妊娠的报道。对于非梗阻性无精子症患者，应该检测染色体核型和Y染色体微缺失。克氏综合征的发病率在新生男婴中占0.2％，无精子症男性中占11％。克氏综合征是一种特殊的染色体异常（47XXY），当其是非嵌合体时，FSH值升高且仅有极少的生精区域。不过50％的这种患者能够在睾丸活检时找到精子，而且行ICSI时的妊娠率达30－50％。对于其他非梗阻性无精子症患者，没有临床评估可以预测取精能否成功。在报道60多例出生的儿童中，约50个做了核型分析均为正常；只有一个胎儿通过产前检查诊断为47XXY。由于在50例中没有非整倍体，95%可信区间上限为6％。在10％的无精子症男性和6％严重少精子男性中发现Y染色体长臂主要在AZFc区的缺失。尚没有在AZFa或b区损伤的男性中找到精子；伴有c区缺失的患者，超过半数的可以找到精子。在27个ICSI周期中有4例妊娠。

对于非梗阻性无精子症和梗阻性无精子症患者行手术取精和ICSI后的妊娠中，由于检查手段有限，染色体异常的发生率目前还不清楚。如果夫妇打算进行产前检查，可以考虑PGD；如果夫妇希望避免生出一个Yq缺失的儿子，那么将有必要进行PGD。

ICSI夫妇的筛查和遗传咨询

无精子症、梗阻性或非梗阻性和少弱精子症（OAT）的原因仍然不清楚，可能有获得性或遗传性。

筛查

建立正确的诊断是充分咨询的前提，尤其是在行ICSI之前。男性检查应当包括:个人史和家族史、体格检查、精液分析、激素检测和核型分析。这些检查可以提示更进一步检查囊性纤维病跨膜转导调节（CFTR）突变或Yq缺失。遗传检测适用于某些罕见的疾病如肌强直性营养不良或聚谷胺酰胺重复伸展与Knnedy病有关。如果男方诊断为先天性双侧输精管缺如，必要时女方也应该提供个人和家族史，进行体格检查、检测CFTR，女方可能也需要根据家谱型心进行核型分析。但是对于女性不孕症患者常规的染色体核型分析不是非常有价值，因为只有0.58％(95% CI 0.28–1.19)有染色体异常。在诊断结束时，进行特定的遗传咨询是必要的，从而使得患者或夫妇能够对以后的治疗做出自己的决定。

引起原发男性不育的原因

如果男性不育症的病因是原发性的，夫妇应该被告知病因有可能是遗传性的，且尤其可能遗传给男性后代。对于少数病例需要通过产前诊断寻找新的染色体畸变。ICSI前行精子的非整倍体筛查可以鉴别高达14％的精子有染色体异常。但是非整倍体筛查是否是一个有效的预测方法仍然不确定。

染色体异常

如果诊断涉及染色体畸变，OAT患者常常是罗伯逊易位或交互易位，通过PGD可以选择正常胚胎，有助于增加健康胎儿的几率。但由于PGD常没有胚胎可供移植，咨询医生应该说明平均每个启动周期PGD成功率较低。隔离研究显示，交互易位携带者可能产生更多的异常精子，关于此类患者的研究将有助于咨询。如果男性患者是一个非嵌合型的克氏综合征病人，不行PGD检查ICSI也能获得成功，但是一旦行PGD检查，发现只有54％的胚胎是正常的。

如果诊断为Y染色体微缺失，这种缺失将会遗传给男性子代。通常如果精子计数小于1×10（6）/ml建议行Y染色体微缺失的检查，并且认为如果计数小于5×10（6）/ml，Y染色体微缺失的几率约14％。夫妇应该行PGD筛选，只移植核型为XX的胚胎。关于囊性纤维病基因，如果男性精子计数低则最好先检查女性是否为携带者，然后检查男性。单侧输精管缺如的一些男性常伴有囊性纤维病基因异常。如果女性染色体正常则后代异常的可能性很小。对于双方均携带至少一个CFTR突变的夫妇，应该行PGD避免囊性纤维病的胎儿出生。表3总结了临床上不同情况男性不育症治疗的选择。

表 3：男性不育夫妇的处理

不育原因 遗传性 再发风险 风险种类 处理 PGD PGS 为什么 目标

原发性 可能 可能 不育，非整倍体 PGS,PND （+） 非整倍 ↑THBR

胚胎染色体异常 超声 体精子

Klinefelter 是 低 非整倍体胚胎 PGD,PND (+) 非整倍 ↑THBR

体胚胎

易位 是 高 不对称胚胎 PGD + (+) 不对称 ↑THBR/ （罗伯逊、 自发流产 胚胎 多种先

交互） 多重异常 天异常

Yq缺失 是 100％男性 不育 PGD选 选择 男性

择女胎 女胎 不育

CBAVD 是 25-50% CF PGD + RR CF达 无CF

/CF 50％ 孩子

PGS, 植入前遗传学筛查；PND, 产前诊断；THBR，健康婴儿率；CBAVD, 先天性双侧输精管缺如；CF，囊性纤维病；RR, 再发风险；＋，推荐；（＋），提倡。

ICSI用于PGD

PGD作为产前诊断的一种，可以避免严重的复发性遗传性疾病遗传给后代。特定的基因突变可以通过单卵裂球PCR或整个基因组扩增检测。伴X染色体疾病患者胚胎的性别和精子数目异常可以通过荧光原位杂交技术(FISH)鉴别。在PGD前患者就应该被告知关于可能存在误诊或无法诊断，仍需要进行证实性的产前诊断以及目前所知道对后代健康的威胁。

ICSI和以PCR为基础的PGD

为了鉴定那些具有高遗传风险的疾病，PGD需要取得并检测代表胚胎或卵子信息的标本。虽然这已经通过检测一个或多个极体实现，但是极体的检测只是推测性的诊断；如果异常的等位基因没有在极体出现，由此推测在卵子出现。这种推理仅用于隐性或性染色体疾病或女性患的显性疾病。在不同卵裂期的胚胎活检能够检测合子的基因组，并发现可能在卵裂期过程中产生的错误。

ICSI和以FISH为基础的PGD

PGS在ICSI周期中的应用

植入前非整倍体遗传学筛查（PGS）的目的是减少移植染色体异常的胚胎，可应用于一些非整倍体高发的疾病中，如严重的少精子症和无精子症和特殊的精子异常（如克氏综合征）(Kahraman et al., 2003。PGS在ICSI中的应用价值尚不明确。有资料显示，对于精子质量差的ICSI后行产前检查，发现新的染色体异常率是1.6％，提示是否是ICSI本身增加了非整倍体胚胎的发生率？关于PGS在ICSI周期中的价值的研究还是需要的，尤其是在无精子症患者中取到精子时。至今还没有证明PGS适用于高龄孕妇或是其他指征，也没有明确的证据证明TESE的非整倍体后代的的发生率更高。因此，对于无精子症患者，胚胎移植前进行非整倍体筛查的研究应继续进行，直到得出明确的结论。

ICSI失败该怎么办？

ICSI失败包括三种情况：取不到精子，受精失败及受孕失败。

取精失败

对于无精子症的男性，存在从睾丸里取不到供ICSI使用的精子的可能性。事实上，人们尝试用各种办法从梗阻性无精子症的人取到精子，约50－70％的非梗阻性无精子症的患者也可以取到精子，如果取不到精子可以考虑使用供精。

ICSI后受精失败

约2％的ICSI周期发生受精失败。经过显微技术操作后所有卵子均不受精的原因仍不清楚，但是可能与ICSI时精子的发育能力较差有关。

关于受精失败和ICSI后受孕失败的推荐解决方法包括：辅助卵子激活即将氯化钙和精子一起注射到卵子内和注射后频繁暴露于钙离子载体。这种方法可以用于临床研究但是不能用于常规操作。

对于尝试下一周期ICSI的患者来说，受精失败并不一定意味着前景很惨淡。对于前一次ICSI受精失败的夫妇打算再行ICSI时，他们的成功率和其他反复行ICSI周期夫妇的成功率差不多。

ICSI受精后受孕失败

和IVF类似，一些夫妇即使经过反复的ICSI周期仍不能受孕，原因有很多。从中心体功能障碍到DNA异常都有可能。有文献报道，200例接受ICSI433个治疗周期没有成功者，随后有23例（12％）最终获得胎儿健康出生。

ICSI的结果

尽管IVF的问世引起了极大的关注，但是仍没有对它做一个正式的系统的评价。很多资料显示，IVF更容易出生早产儿和低体重儿。尽管这些问题主要源于IVF多胎妊娠的高发生率，但是在IVF的单胎妊娠中发生这些情况的也很多。当ICSI问世后，人们主要关注它操作的侵入性和使用精子的类型。

围产期风险

和双胎妊娠一样，IVF、ICSI的单胎妊娠的围产期死亡率、早产和低体重儿的风险也很大。多胎妊娠的胎儿自然减灭可能是新生儿期不良后果的原因之一，而且不育本身也可能是原因之一。IVF和ICSI的结果基本相似。

先天性异常

遗传性染色体异常的高发生率被发现主要与父方染色体结构异常有关，而新的染色体异常其高发生率与父方精子性状有关。在大多数的研究中IVF和ICSI的畸形率相当，二者的畸形率均比普通人群高。少数研究报道特定器官系统的畸形率增加，但是没有相应的其他研究论证。对照研究也指出与普通人群相比ICSI可能有更高的畸形率。

长期随访

近期的长期随访研究表明，虽然IVF、ICSI的5岁独生子女大体上与自然出生的同龄儿童没有差别，但是他们似乎在最初的五年里需要更多的保健，不排除父母过度关心的影响。ICSI后代患有更多的先天性异常，部分因为大量的男性泌尿生殖道异常没有在新生儿期被查出。和相关家庭的心理健康一样，孩子的健康指标如生长和认知、情感的发育也是需要保证的。

印记疾病

关于IVF、ICSI后代所患印记相关疾病（如Angelman 和 eckwith–Wiedemann综合征）的报道，认为体外培养程序可能有一定的风险，应进一步研究(Maher et al., 2003)。Ludwig等以这些综合征和印记基因相关的特定表型为目标的系统调查，或许可以阐明基因调控异常在ART(或生育力低下)中所起的作用是否比在普通人群更大。此外，这个领域的基础研究将会阐述激素刺激和体外培养的可能影响。

ICSI周期中的卵巢微刺激方案

多年来，IVF一直采用刺激性的超排卵增加每周期的妊娠率。卵巢刺激的过程复杂、费时，给患者带来不适，造成由于医源性双胎而引起的无法承受的风险，而且卵巢刺激综合征的发生率也令人担忧。不过，ICSI周期是卵巢微刺激方案使用的自然范畴，因为女方的卵巢功能往往是正常的。

卵巢微刺激的基本原理

卵巢微刺激相对简单、省时、费用较低，而且由于副作用较少，更容易被病人接受。更低的费用使得女性可以承受更多的周期、拥有其他的受孕机会。或许IVF周期的平均妊娠率会有所下降，但是如果患者在不增加额外费用的情况下，接受更多的周期，那么总的妊娠率便会与超排卵相当而且更安全。

卵巢微刺激方案的生理原理是FSH的值维持在正常月经周期中单个优势卵泡发育所必需的水平。在存在LH峰提前出现危险的时期使用GnRH拮抗剂，此时一些在正常周期中将闭锁的卵泡可以被低剂量的FSH拯救而不闭锁。

在月经第五天开始使用FSH 100－150IU/d，联合GnRH拮抗剂以防卵泡直径超过14mm，可以诱导多个优势卵泡的生长，在大多数病人能取到1－15个卵子。刺激的持续时间明显减少。大部分妊娠发生在取到1－6个卵子的妇女。不过，即使短期使用了GnRH类似物还是需要黄体支持。

微刺激的概念是经过多中心的RCT测试的，涉及400对夫妇几乎800个IVF周期，比较了4个微刺激周期（单胎移植）和3个传统的GRnH-a长方案促排卵（双胚胎移植）,两者超过一年的足月产的累积妊娠率相似，约45％。微刺激周期中预期结果的下降会得到平衡，因为在一年内可以做更多的微刺激IVF周期。实际上多胎妊娠在微刺激周期已基本消失，且总的治疗成本也得到降低。

ICSI周期单胎移植（SET）

单胎移植是通过降低多胎妊娠来提高IVF周期安全性最有效的方法。在一项选择性单胎移植研究中所有的知情同意病人不考虑年龄、胚胎的质量，SET的妊娠率明显比双胎移植低（21％和40％），但是双胎妊娠率分别是0％和21％。因此，SET并不适用于所有的病人，但是当应用于预后好的患者任何妊娠率降低的可能均可以被大量的低双胎妊娠率及大量可供冷冻的高质量胚胎所平衡。这样就能为新鲜周期失败的患者提供额外的受孕机会。

SET在ICSI周期中应用的效果应当以不断的研究为基础。

建议

1、适应症 证据表明ICSI最主要的适应症是严重的精子缺乏。对于非男性因素或不明原因不育，在临床结果方面ICSI比常规IVF没有明显的优势。

2、遗传学 对于严重男性不育症的患者遗传咨询的质量取决于临床诊断的准确性。造成许多严重男性不育的原因不祥，这些患者中都可能存在遗传因素。

＊ 需要进行研究确定精子非整倍体检测在帮助遗传咨询医生预测胚胎染色体异常中的作用。

3、睾丸取精对后代的影响 在非梗阻性无精子症患者的妊娠中非整倍体胚胎的数目更多，而且可能有隐性的、严重或不严重的先天性异常。关于睾丸取精ICSI出生胎儿结果的系统性随访报告还没有公布。

＊ 有必要对经睾丸取精出生的孩子进行随访。

4、PGD

＊ 应当鼓励对于经胚胎活检、植入前遗传学诊断和筛查后出生的婴儿进行随访研究。

5、ICSI儿童的随访研究 由于高的失访率，长期的随访是很难实现的，特别是父母经常在不同城市间活动的更难实现。

＊ 需要进行更多的随访并加大当前研究。

＊ 需要对ICSI子代的新生儿及长期健康与自然妊娠出生的新生儿是否有区别进行研究，如果有，这些差异在IVF和ICSI是否相同。

＊ 需要进行以接受非辅助生殖技术治疗或没有经过治疗而怀孕夫妇的子女为对照组的研究。

6、最佳ICSI方案 多个卵泡募集对ICSI周期来说不太重要，因为周期中女方的排卵功能通常是正常的。在ICSI周期中，卵巢微刺激方案或许是一个现实而明智的选择。

＊ 登记处的最终登记应该改成治疗超过一段时间（可能不止一个周期）健康婴儿出生的可能而不是每周期的妊娠率。

＊ 需要在不同的临床机构进行更进一步的研究，令人信服地证实卵巢微刺激方案在医疗、健康、经济和心里方面的优点。

7、SET 多胎妊娠是IVF/ICSI治疗最常见严重的并发症。这种危险可能源于这样的观念:认为移植的胚胎越多妊娠率就会越高。事实上，移植两个胚胎总的妊娠率会轻度增加，但是移植一个胚胎的单胎妊娠率（比率是单胎而不是双胎）更高。由于受精率高，ICSI周期可以产生更多的胚胎，从中可以选出胚胎移植或冷冻。

＊ 需要研究选择什么样的胚胎供SET。

＊ 需要进行定性研究分析夫妇如何决定移植胚胎的数目，以及形成ART临床辅助决策为目的的研究。

需要在更多的临床实践机构进行研究评估S