HBV感染对人工辅助生殖的影响及其防范对策
朱彤，李成忠
海军军医大学第一附属医院
1HBV感染对人工辅助生殖的影响
ART是通过在体外收集精液，控制性超促排卵后取卵，将精子和卵子行体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子显微注射（ICSI）等方法，发育成早期胚胎后行胚胎移植回母体子宫，经妊娠后分娩的过程。本章节将从ART中女性及男性生殖细胞、实验环境、妊娠结局和子代健康等方面来探讨HBV感染对ART的影响。
1.1HBV感染对女性生育能力及生殖细胞的影响
Lee等和周旭平通过评估卵巢储备能力以及卵巢对超促排卵的反应来判断HBV感染和未感染的女性生育能力是否有区别，他们从ART过程中使用的促性腺激素剂量、血促性腺激素持续时间、≥16mm卵泡数、人绒毛膜促性腺激素使用当天雌二醇水平、获得的卵母细胞数等发面比较发现，女性HBV感染者与未感染者的卵巢反应无明显差别。然而柳榴等却发现HBV感染的女性中，HBVDNA高拷贝数时可使卵巢储备功能低下。
母婴之间的垂直传播是HBV传播的主要途径之一，分为产前传播、产时传播及产后传播。经生殖细胞传播是产前传播的主要方式。Ye等通过免疫组化及原位杂交的方法在HBV感染的女性卵母细胞中发现HBsAg、HBcAg和HBVDNA，同时HBcAg和HBVDNA可见于卵母细胞的不同阶段。还有学者在卵母细胞及胚胎中也发现HBsAg及HBVDNA，且血清HBVDNA水平与卵母细胞及胚胎的HBVDNA阳性率呈正相关。有试验从引产的早期胚胎（46d内）发现HBsAg，此时胎盘循环并没有形成，其父亲HBsAg阴性，这间接证明了HBV可通过卵母细胞传给胚胎。在动物实验中发现HBVDNA能够穿过透明带和卵细胞膜整合至小鼠的卵母细胞基因组中。这些均提示HBV可在卵母细胞内复制，通过受精方式传递给早期胚胎，垂直传播给子代。
有趣的是，在HBV感染的女性的不同卵母细胞中有的表达HBVDNA，有的不表达，具体机制目前还不清楚，这就是为什么HBV阳性女性的后代有的感染HBV，有的没有。分析ART获得的卵母细胞发现，感染模式仅HBsAg阳性的女性，卵母细胞及胚胎中HBV感染率是77%，在同时合并HBeAg阳性或HBVDNA阳性时，感染率为50%~100%，与自然妊娠过程中HBV传染率无差异。
1.2HBV感染对男性生殖细胞的影响
早在1985年时，在HBV携带者的精子中发现了HBVDNA，随后多项研究表明HBVDNA可穿过血睾屏障，进入男性的生殖细胞，整合到基因组及染色体中，增加基因组的不稳定性，引起精子畸变、粉碎、断裂。叶峰等通过检测9例HBV感染的父亲体外受精后遗弃的共18个胚胎的HBVmRNA，结果显示阳性率为1/18(5.6%)。这些均提示HBV可通过精子以受精方式传递给早期胚胎并在其中复制，垂直传播给子代。
然而关于HBV感染是否影响精子的功能目前存在争议。多项研究发现HBV感染者精子存活率、正常形态率、数目、精液密度均较对照未受HBV感染的不孕组降低。Lee等收集了154例HBsAg阳性和1473例HBsAg阴性患者的精液，发现HBsAg阳性组的精子正常形态率较HBsAg阴性组低。Lorusso等从精液的浓度、精子存活率、正常形态率方面比较发现HBV感染组（30例）较未感染组（130例）低。Qian等发现正常对照组（30例）患者的精子的量、pH值、密度、精子存活率、形态正常率较未受HBV感染的不育组（30例）高，比受HBV感染的不育组甚至更高。Zhou等通过比较457例HBV阳性和459例HBV阴性的精液，发现HBV感染者精子的量、形态、运动能力较未感染组低。Oger等通过比较32例HBV感染和64例未感染者的精子运动能力，发现HBV感染组明显低于未感染组。
HBV感染增加了精子细胞坏死和凋亡的比例，破坏了精子膜的完整性，引起精子线粒体膜丧失，导致精子的功能降低。HBV包膜蛋白的主要成分HBs蛋白可通过促进ROS生成、脂质氧化，激活caspases以及DNA降解，从而加速精子细胞凋亡，使细胞膜完整性丧失，导致精子失能，影响受精能力。
其他学者认为精子参数比如精液密度、精子运动能力、精子数量及形态与未受HBV感染的不孕男性之间没有区别。另外，精液的质量与HBVDNA载量是否呈负相关仍没有统一定论，Vicari等认为HBVDNA载量越高，精液质量越低，而Oger等则认为两者之间没有相关性。
1.3实验室交叉传播风险
在卵泡液和精液中均可发现HBVDNA，若操作不当、管理不到位，实施ART过程中可将病毒传播给配子或胚胎，尤其在冻融过程中，冻存管发生破裂或样品露出，污染液氮储存罐，有传染给其他未感染者的配子及胚胎可能，发生交叉感染。另外，实验室医务人员可能会通过针刺、皮肤黏膜损伤后接触而感染，受感染后的实验人员也会成为传染源，在实施ART操作中将病毒传给配子或胚胎。
1.4HBV感染对ART妊娠结局的影响
目前关于HBV感染对ART妊娠结局包括受精率、胚胎质量、着床率及妊娠率的影响一直存在争议，报道结论并不一致。
Lee等发现夫妻双方均为HBV感染者的妊娠率及活产率与夫妻单方HBV感染及双方HBV均阴性者无明显区别，认为HBV感染对ART结局无明显影响。还有学者发现男性HBV感染时即使精子功能或形态受影响，但是对ART妊娠结局没有影响，他们认为精子形态学评估并不能预测ART的结局。Shi等和Oger等发现男性HBV感染者行IVF时尽管受精率较阴性对照组低，但是2组的胚胎质量、着床率及妊娠率相当。可能因为即使精子功能受影响，受精率低或者正常，在ART实施过程中，当正常的精子形态低于3%时，采用ICSI技术，从而补偿了精子受损引起的不良反应。另外在ART操作过程中往往会选择高评分的胚胎及在胚胎评分低时增加胚胎移植数量，而着床率和妊娠率与胚胎质量及胚胎转移数有关，这就是对ART妊娠结局无影响的原因。
Pirwany等以年龄分组发现HBV感染的夫妇着床率及妊娠率较同龄对照组低。女方血清HBVDNA≥1.0×10^5拷贝/ml时ART的流产率显著增加。Lam等则研究得出女性HBV感染者行ART后较HBV阴性组有高着床率、临床妊娠率和持续妊娠率。各项结论的不一致性可能与不同地区HBV亚型不同、样本数、子宫内膜情况以及其他一些来自母体方面的不可控的因素有关。
另外，通过比较ICSI和IVF发现，男性HBV感染时，行ICSI时妊娠结局较HBV阴性对照组低，而行IVF治疗时，妊娠结局却无影响。其原因可能是ICSI主要用于精液严重异常的夫妇，如正常精子形态低于3%或小于10万个活动精子等。
1.5HBV感染者行ART母婴健康及子代感染率状况
关于HBV感染者行ART后母婴健康状态的随访研究并不多。黄舒昊和倪丽莉分别通过随访行ART助孕妊娠成功HBV携带和非HBV携带的不孕夫妇，发现HBV携带者实施ART不会明显增加妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、前置胎盘、卵巢过度刺激综合征等并发症。但是HBV携带者ART后孕期肝功能损害的发生率，黄舒昊统计为4.46%，倪丽莉统计为15.22%，但均低于HBV携带者的自然妊娠资料（25%~47%）。新生儿窒息率和子代出生缺陷HBV携带和非HBV携带的不孕夫妇无区别，但对比IVF和ICSI两种受精方式，黄昊舒发现ICSI方式受精的子代先天畸形风险显著高于IVF方式受精，而倪丽莉却认为HBV携带者IVF和ICSI方式受精之间子代先天畸形率差异无统计学意义。两个试验由于样本量有限，需待进一步研究证实。
对于HBV感染者行ART后子代HBV感染率的情况，研究发现在乙型肝炎疫苗接种率相同的情况下，仅男方为HBsAg、抗-HBe、抗-HBc3项均阳性的夫妇，其子代感染率低于对应的自然妊娠，其余HBV携带状态下的子代感染率与自然妊娠相同，他们认为子代总体的HBV感染率较自然妊娠低。郝大勇等调查172例HBV阳性夫妇，经IVF助孕出生的224例婴儿中，在正规接种乙型肝炎疫苗的情况下，无一确诊感染HBV。女方HBV感染者，无论HBV携带形式如何，其子代感染率均低于对应的自然妊娠HBV感染率；男方HBV感染HBsAg、HBeAg、抗-HBc3项均阳性患者（研究资料仅2例），子代感染率高于对应的自然妊娠资料外，其余HBV携带状态下的子代感染率均低于自然妊娠资料。且IVF和ICSI方式受精之间，HBV感染者子代HBV感染率无差异。因此体外培养不会增加HBV的垂直传播风险，可能因为HBV携带者的血清、卵泡液、精液在体外培养过程中不断被洗涤，反而减少了IVF及培养环境中的HBV含量，一定程度上降低了HBV通过感染配子途径造成的垂直传播。
1.6ART中药物对肝脏的影响
ART过程中涉及的药物包括促排卵过程中使用的促性腺激素释放激素激动剂、重组卵泡刺激素、人绒毛膜促性腺激素以及妊娠过程中治疗先兆流产的药物等。HBV感染者本身存在肝脏损伤的基础，这些药物的使用可能会诱发肝脏的进一步损害，如促性腺激素释放激素激动剂有文献报道可引起肝功能损伤，临床上偶尔可见到一些治疗先兆流产药物引起肝功能损害。然而关于这类药物对肝脏影响的研究和报道并不多，但临床工作在应用时需略加重视，密切监测相关指标。
2HBV感染者实施ART防范对策
2.1ART前
HBV监测对于需实施ART的夫妇，为了减少HBV在ART中的传播风险，需常规检测乙型肝炎两对半、HBVDNA以及肝功能等指标。其具体诊疗应与自然妊娠分娩相同。对于女性患者若肝功能异常，有治疗适应证，应尽量在开展ART前应用干扰素（IFN）或核苷（酸）类药物（NAs）治疗，以期在ART前6个月完成治疗，待肝功能好转后再启动ART周期。对于男性抗病毒应用IFN治疗者，停药6个月后可考虑ART；应用NAs者，尚无证据表明NAs对精子的不良影响，可在与患者充分沟通前提下考虑ART。郑州大学第三附属医院生殖医学中心要求在实施ART之前助孕者血清HBVDNA＜1×10^4拷贝/ml。浙江大学附属妇产科医院生殖内分泌科将血清HBVDNA阳性和HBV感染伴肝功能损害列为禁忌证，待治疗后HBVDNA转阴、肝功能好转后再启动ART周期。妊娠期间需密切检测肝功能，ALT轻度升高者可密切观察，肝脏病变较重者，可使用替诺福韦酯或替比夫定抗病毒治疗。
2.2提高ART，减少HBV传播
HBV感染者的精液及卵泡液中均存在HBVDNA，大量研究显示，采取有效的精子洗涤方法，可以降低或去除精液中的病毒颗粒。通过洗涤卵冠丘复合体以及受精后转移、更换培养液的方法可稀释病毒拷贝数的作用，降低或阻断胚胎被感染的危险，从而避免病毒垂直传播，提高ART的安全性。
部分学者认为ICSI技术要求单个精子与单个卵子接触，可以很大程度上避免暴露于可能被HBV污染的精液和卵泡液中，减少病毒传播的风险。而另有不同的观点认为ICSI的注射操作很可能直接将病毒颗粒带入卵母细胞，还有学者认为IVF和ICSI对于HBV的传播无差别。
2.3加强实验室管理，防止交叉感染
在实施ART之前，HBV检测为必须检测的一项指标，HBV感染者实施ART时，建议将感染HBV与未感染HBV夫妇采用不同的实验室。放置过污染样品的培养箱使用完毕后应经过严格的清洁消毒处理方可使用。液氮储存罐最好分为污染和非污染罐，将精子、卵母细胞、胚胎分开保存。
所有实验室人员需进行乙型肝炎疫苗接种；严格遵守实验室安全规定，避免针刺；穿防护服，使用防护用品；严格遵守手部卫生；严格执行传染性废物管理，防止向实验室人员传播。实验室空气要用Ⅱ类垂直层流柜100%再循环过滤。
2.4母婴传播阻断
当母亲血清HBVDNA水平＞2×10^6IU/ml时，在妊娠第24~28周开始给予替诺福韦酯或替比夫定口服抗病毒，使孕妇产前血清中的HBVDNA水平降低，提高母婴阻断成功率。建议于产后1~3个月停药，停药后可母乳喂养。
乙型肝炎疫苗接种是预防HBV感染最有效的措施。孕妇HBsAg阴性时，新生儿按“0、1、6个月”3针方案接种疫苗，对HBsAg阳性母亲所生新生儿，应在出生24h内尽早（最好在出生12h）内注射乙型免疫球蛋白和全程接种乙型肝炎疫苗（即“0、1、6个月”3针方案）。采取正规预防措施后，对HBsAg阳性而HBeAg阴性孕妇的新生儿保护率为98％～100％，对HBsAg和HBeAg均阳性孕妇的新生儿保护率为85％～95％。新生儿在出生12h内注射乙型肝炎免疫球蛋白和乙型肝炎疫苗后，可接受HBsAg阳性母亲的哺乳。
3结论与展望
目前，国内外在HBV感染对ART影响的研究主要集中在对生殖细胞作用方面，对妊娠结局、母婴健康状态、不同的受精方式之间是否有区别等回顾性的研究相对较少，结论尚未统一，具体机制仍有待进一步的阐述。进一步的探究可促进ART的不断改进和提高，降低HBV传染风险。
引证本文：朱彤,李成忠.HBV感染对人工辅助生殖的影响及其防范对策[J].临床肝胆病杂志,2019,35(7):1425-1429.
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